ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА) – это современный способ распознавания огромного количества возбудителей болезней, основанный на способности человеческого организма вырабатывать так называемые антитела в ответ на обнаружение чужеродных веществ – антигенов.

В настоящее время ИФА анализ крови используется:

для диагностики множества ЗППП;
с целью выявления предрасположенности к тем или иным болезням, обусловленным наследственностью;
с целью выявления той или иной стадии заболевания;
с целью контроля эффективности лечения.

Так, например, широкое распространение этот метод получил при диагностике следующих заболеваний:

Что касается общемедицинской практики, то в этом случае иммуноферментный анализ крови позволяет:

выявить эндокринные патологии, например, такие, как сахарный диабет;
оценить вероятность возникновения инсульта или инфаркта;
понять, насколько хорошо работают системы организма;
выявить наличие аллергических реакций;
оценить работу иммунной системы;
оценить состояние репродуктивных функций организма.

Материалом для исследования в данном случае может являться как венозная кровь, так и жидкость, находящаяся в стволе спинного мозга, секрет стекловидного тела, околоплодные воды.

Иммунная и ферментативная реакции

Как явственно следует из названия, анализ крови ИФА включает в себя несколько составляющих, а именно – иммунную и ферментативную реакции.
Иммунная реакция позволяет связать клеточные элементы и болезнетворные микроорганизмы, а ферментативная дает возможность визуализировать и оценить результат предыдущей реакции.

Рассмотрим каждую реакцию более подробно.

Что такое иммунные реакции?

Иммунными называются специфические реакции, позволяющие связать антиген с антителом и создать иммунный комплекс. Что же это значит? В первую очередь, необходимо понимать, что любая клеточная поверхность содержит молекулы, содержащие данные о клетке, называющиеся антигенами и подразделяющимися на:

индивидуальные;
видовые.

Индивидуальные антигены, несмотря на некоторую схожесть, имеют и множество различий. Они имеются у одного конкретного организма и никогда не повторяются в других. Видовые антигены можно обнаружить в организмах тех или иных видов живых существ. Так, например, обезьяны, лошади или собаки имеют свой, ни на что не похожий антиген. Именно поэтому антигены этого типа используются иммунной системой для распознавания своих и чужих клеток, что, собственно говоря, и лежит в основе иммуноферментного анализа крови.

Как распознаются антигены? Здесь все достаточно понятно. Говоря простым языком, клетка, являющаяся иммунной, отлавливает клетку, вызвавшую у нее «подозрение», и сравнивает ее антиген с имеющимся в памяти описанием. Если антиген вызвавшей сомнение клетки соответствует ему, то иммунная клетка «отпускает» ее и отправляется дальше. Если же описание отличается, то ответ организма на угрозу один – уничтожение. Причем распознавание «врага» в данном случае равняется почти 100%.

Что собой представляет антитело?

По своей сути антитело, имеющее огромное значение при использовании метода ИФА, является специальной молекулой, существующей на поверхности иммунной клетки и позволяющей последней связаться с антигенами сомнительного микроорганизма. Именно антитело служит проводником данных, позволяющих оценить угрозу, и именно оно получает сигнал о том, какой является сомнительная клетка – своей или чужеродной. В случае, если захваченная клетка является «своей», антитело выпускает антиген и высвобождает его «хозяйку».

Для чего нужен иммунный комплекс?

Как уже говорилось несколько ранее, при распознавании чужеродной клетки антитело не выпускает антиген чужеродной клетки. Наоборот, посылая определенные сигналы, оно зовет на помощь «подкрепление». В данном случае речь идет о том, что все остальные антитела, расположенные в другой части клетки, являющейся иммунной, начинают движение к участку, сигнализирующему об опасности, и связывают себя с захваченным антигеном, фиксируя его и окружая со всех сторон. После того, как антиген будет полностью окружен, начинается уничтожение чужеродного микроорганизма.

Антитела

Антитела, которые позволяет выявить ИФА диагностика, представляют собой белковые структуры – иммуноглобулины, подразделяющиеся на несколько видов:

IgA;
IgM;
IgG;
IgD;
IgE.

Однако для диагностики берется лишь один вид антител, являющийся наиболее специфичным в отношении искомых микроорганизмов. Как правило, подобными антителами являются разновидности IgG и IgM.

Что такое ферментативные реакции?

Ферментативными называются реакции, позволяющие одно вещество превратить в другое. Материал, на который воздействуют в ходе исследования крови методом ИФА, носит название «субстрат», а материал, получаемый под воздействием фермента, носит название «продукт реакции». Причем особенности данного процесса таковы, что воздействовать тот или иной фермент может исключительно на конкретный субстрат. Подобное свойство фермента определять «свой» субстрат носит название «сродство». Исходя из вышесказанного, становится предельно понятно, что с каждым ферментом связана исключительно одна, специфичная исключительно для него реакция.

При этом стоит отметить, что метод ИФА диагностики подразумевает использование не более десятка реакций ферментативного типа, вследствие которых образуются колорированные вещества, позволяющие использовать для определения концентрации возбудителя метод химической реакции – колориметрию.

Что такое колориметрия?

Колориметрия – это способ измерения концентрации вещества в зависимости от того, какой является плотность окраски раствора, подразумевающий использование специально предназначенного для этого прибора – колориметра.

Причем в этом случае возможны две вариации зависимости плотности окраски раствора от его концентрации:

прямо пропорциональная;
обратно пропорциональная.

В первом случае плотность окраски раствора увеличивается при увеличении его концентрации, во втором же плотность окраски раствора снижается при увеличении его концентрации. Технически это осуществляется следующим образом. Берутся несколько растворов, обладающих определенной концентрацией вещества, производятся замеры их плотности, и далее выстраивается график зависимости плотности окраски раствора от его концентрации. Затем измеряется плотность окраски испытуемого раствора, и по выстроенному графику находится величина его концентрации, находящаяся в соответствии с замеренной плотностью окраски раствора.

Причем использующиеся для замера колориметры после единичной калибровки способны сами отстроить кривую калибровки, остающуюся в их памяти и позволяющую им работать в режиме автомата. Стоит отметить, что в ИФА крови, как правило, используются такие ферменты, как авидин, пероксидаза и щелочная фосфотаза.

Способы проведения ИФА

В зависимости от способа проведения исследование ИФА подразделяется на прямое и обратное. Рассмотрим каждый из способов более подробно.

Что такое «прямой иммуноферментный анализ»?

Прямой иммуноферментный анализ подразумевает использование антител к определяемому антигену, соединенных специальной меткой, являющейся субстратом реакции, носящей ферментативный характер. Исходя из этого, прямой ИФА — это анализ забранного у пациента биологического материала, помещенного в лунки с последующим добавлением антител к антигену того или иного заболевания.

Таким образом, при выявлении сифилиса в лунки будут добавлены антитела против сифилитических антигенов, полученные на производстве и закупленные лабораторией. Полученная смесь оставляется на время, требуемое для того, чтобы антитела захватили «свой» антиген. Причем, как было сказано ранее, антитела, запускающие реакцию, связываются и со специфической меткой.

Ввиду того, что антител добавляется много, далеко не все они смогут захватить антиген в случае его нахождения в пробе. Для того, чтобы избавиться от лишних антител, жидкость из лунок выливается. Антитела же, связавшиеся с антигенами, остаются на их поверхности. Затем приступают ко второй части анализа на ИФА – ферментативной реакции. В лунки добавляется ферментный раствор и оставляется в них на полчаса либо на час. Вполне естественно, что добавленный фермент аналогичен метке, связывающей антитела. В конце реакции в лунке оказывается вещество, приобретшее соответственный оттенок.

Окрашенное вещество исследуется колориметром. Причем ввиду того, что метка, имеющаяся в лунке, уже связалась с антителами, концентрация окраски образовавшегося там вещества будет соответствовать концентрации антител, аналогичной по размеру количеству антигенов. Таким образом, анализ позволяет понять, сколько выявляемых микроорганизмов или гормонов содержится в забранной пробе.

Что такое непрямой иммуноферментный анализ?

Непрямой анализ крови на ИФА производится в 2 этапа. На первом этапе используются антитела без меток, добавляемые к требуемым определения антигенам, а на втором – антитела с метками к первым антителам без меток. Таким образом удается осуществлять двойной контроль реакции:

антитела осуществляют связь с антигеном;
следующие антитела связываются с антителами, связанными с антигеном.

Осуществляется анализ следующим образом. У пациента забирается биологический материал, вносится в лунки и оставляется до того момента, пока антигены не приклеятся к их поверхности. Затем к нему добавляются антитела без меток и оставляются на время, требуемое для того, чтобы они связались с имеющимися антигенами, создав требуемый иммунный комплекс. После того, как процесс связывания будет окончен, излишние антитела удаляются посредством выливания жидкости из лунок.

По окончании этого процесса берутся следующие антитела (помеченные), добавляются в лунки и оставляются на время, требуемое для образования комплекса из 2-х антител и антигена. Затем раствор также выливается (с целью удаления излишних антител).

На следующем этапе непрямого анализа крови методом ИФА вносится фермент, превращающий «метки» в вещество, имеющее цвет. Развитие окраски в данном случае занимает от пяти минут и до получаса. После проявления окраски производят колориметрию и определяют концентрацию раствора, имеющего окраску. Ввиду того, что данная величина в указанном случае соответствует концентрации антител с метками, которая равна концентрации антигена, в конце исследования можно получить представление о количественном содержании возбудителя заболевания.

Как расшифровываются анализы крови методом ИФА?

В современном мире медицины расшифровка анализа крови методом ИФА позволяет не только диагностировать заболевание, но и понять, в каком состоянии оно находится по типу антител, присутствующих в данный момент в организме. Таким образом, всего один анализ позволяет определить острую или хроническую стадию течения болезни. Так, например, присутствие антител IgM говорит о том, что заболевание находится в стадии острого течения.

Подобный тип антител возникает сразу же после заражения и находится в организме только что заболевшего человека. Затем антитела IgM исчезают. Таким образом, при наличии этих антител требуется сразу же назначить лечение.

При наличии антител Ig G, появляющихся в организме после того, как человек выздоровел, и находящихся в нем постоянно, необходимости в лечении нет ввиду того, что они лишь говорят о процессах, приобретших хроническую форму. Антитела подобного вида являются своеобразным маркером того, что больной когда-то перенес это заболевание и остался его носителем на всю жизнь.

Если же в биологическом материале обнаруживаются и антитела IgM, и Ig G, расшифровка иммуноферментного анализа будет говорить о том, что у больного произошло обострение хронического заболевания, требующее проведения соответствующей терапии. Существует и еще один типа антител – Ig А, который говорит об острой стадии заболевания. Такие антитела сохраняются в организме на протяжении 4-5 недель и исчезают после выздоровления. Наличие подобных антител говорит о том, что больной является потенциальным переносчиком того или иного заболевания.